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菌體或者細胞裂解法中哪些需要用到離心機

發布時間:2021-9-22 17:9:30??????點擊:

  離心機在菌體或者細胞裂解法中都會應用到。

  今天就例舉幾個常見的方法,進行簡單得匯總:

  一、反復凍融法:

  1、將細胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復幾次,由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎。

  2、至少3次以上凍溶。

  3、IFCC推薦法:

  收集細胞懸液,將離心機設置4℃低溫離心(3000rpm,5min),棄上清,加入一定量PBS(200ul),輕輕吹打混勻,-200C 冷凍30 min,370C 解凍,如此反復3次,可形成細胞裂解液。

  4、用液氮凍融三四次就可以了,細胞凍住后,取出放37度水浴,溶解后震蕩,再凍。

  二、超聲波處理法

  1、要設定好超聲時間和間隙時間,一般超聲時間不超過5秒,間隙時間最好大于超聲時間,這些都有利于保護酶的活性。我的實驗超聲時間5秒、間隙時間10秒、工作次數20次。

  2、每個樣本超聲時間5秒,每個間隔5秒,粉碎5次。

  3、100ml菌液用離心機離心,用8ml緩沖液懸浮,加8mg溶菌酶,冰浴30min,然后超聲處理。750W 40%功率。5秒超聲,9秒間隔。超聲至少90min。

  4、綜合凍融和超聲的方法:

  1500g離心,棄除上清。冰上,用小體積PBS重懸細胞。

  將重懸液集中,1500g離心濃縮,棄除上清。液氮驟冷。用約5倍體積的PBS緩沖液重懸細胞,并攪拌。

  可選擇:4℃下超聲破碎細胞。加入終濃度為0.25M的KCl,15mM的DTT。4℃下111500g×60min離心裂解液。取出上清。過柱子。

  三、裂解液處理法:

  1、細胞裂解液:50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8,100 mmol/L DTT,2% SDS,0.1%溴酚藍,10%甘油。SDS是陰離子型表面活性劑、極易促溶、強變性作用。

  2、在loading buffer加SDS,100度5分鐘,是變性方法。SDS與蛋白等量結合,可以通過條帶位移判斷蛋白大小,考染不會影響結果。

  3、如果是做小量菌液,跑PAGE膠看其表達情況的話,可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分鐘即可,需注意的是上樣前要離心12000rpm至少5分鐘,然后上樣時,槍頭別吸最底下的。

  4、20毫升細胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0),4 ml 10% SDS,1 ml 1M Tris-cl(PH6.8),14.96 ml 蒸餾水。

  5、我始終未明白樓主如果想收集全蛋白,而不考慮包涵體的話,為何要用超聲呢?直接水煮不就可以了嗎?

  6、將1ml菌通過離心機離心棄上清,留大概50ul,再加50ul 2×上樣緩沖液,煮10min,取20ul上樣,就可以了。

  7、檢測蛋白誘導:

  從培養的不同時期各取出1ml,12000g×1min離心。將沉淀重懸于100ul 1×SDS上樣緩沖液(50mM Tris-Cl(pH6.8),100mM DTT,2%SDS,0.1%溴酚藍,10%甘油)中,100℃加熱3min,然后12000g×1min離心。上樣15ul,6%SDS-PAGE電泳。

  《分子克隆》P826

  8、5-10秒離心,棄除上清,用50ul蒸餾水重懸沉淀。加入1ul PMSF,再加入50ul熱的2×SDS上樣緩沖液(100℃加熱)。迅速混勻后100℃加熱3-5min。將樣品冰上放置(或-20℃放置),然后再溶解,煮沸1min。離心30秒。上樣5ul進行SDS-PAGE電泳。

  2×SDS上樣緩沖液:250mM Tris-Cl,6.2%(w/v)DTT,8%SDS,0.002%(w/v)溴酚藍,40%甘油。

  Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

  9、裂解液:50mMTris-HCl(pH8.5~9.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。

  10、我們用NP40(NP40:NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇,是一種非離子表面活性劑。)加DTT和蛋白酶抑制劑裂解細胞,冰上放30-60min,然后13000rpm離心15min,取上清定量。

  11、裂解液配方是:50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0),150mmol/L NaCI,0. 02% 疊氮鈉,100μg/ml PMSF,1μg/ml Aprotinin,1% Triton X-100 ( or NP-40)。

  12、對于組織培養中生長的細胞,最有效的裂解方法是用去污劑(表面活性劑)進行處理,溶解細胞膜并溶解蛋白質。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 疊氮鈉、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ,這種裂解液可能是最常用的裂解緩沖液。

  13、細胞裂解液的主要目的:(1)利用去污劑破壞脂質雙分子層,破裂細胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白變性使其穩定;(4)抑制蛋白酶活性。

  推薦RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4(緩沖體系),150 mM NaCl(等滲體系),1 mM PMSF (強大的蛋白酶抑制劑),1 mM EDTA(變性劑和穩定劑),5 ?g/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑),5 ?g/ml Leupeptin(蛋白酶抑制劑),1% Triton x-100(破壞細胞),1% Sodium deoxycholate(中度變性劑和蛋白溶解劑),0.1% SDS(強變性劑和蛋白溶解劑)。

  14、裂解buffer:50mM HEPES pH7.0,1mM 甘油,1mM DTT(還原劑),7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),1mM EDTA(金屬鏊合劑),1mM PMSF,1mg/ml leupeptin,1mg/ml aprotinin,1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制劑),50mM NaF(ph7.0)(anti hemoaggulating),1mM Na3VO4(ph7.0)(inhibitor of phosphatases),2mM benzamidine(inhibitor of trypsin)。

  15、可選擇:取0.5ml誘導的細胞并離心2min。棄除上清,用100ul 1×SDS上樣緩沖液重懸,冰上放置。

  6000rpm×10min離心培養物。棄除上清,用10ml預冷的裂解液重懸沉淀。液氮驟冷細胞或-20℃冷凍細胞。在冷水中溶解細胞。15秒、4次超聲處理細胞。冰浴降溫。4℃,9000g×30min離心。取上清。

  裂解液:5 mM DTT,15 mM KCl,5 mM MgCl2,50 mM HEPES, pH 7.9,1 mM EDTA,10 mg/ml溶菌酶(臨用前加上DTT和溶菌酶)。

  Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol

  16、收集細胞。在液氮中突然冷凍細胞。用含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液懸浮沉淀。用100 ?g/ml溶菌酶處理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine (終濃度1.5%),然后超聲波破碎。16000 rpm×30 min離心。取上清然后加入Triton X-100至終濃度為2.0%。過Ni-NTA?瓊脂糖柱層析。

  以上就是關于離心機在一些常見實驗中得應用,如果您還想了解更多有關應用知識,可以來上海盧湘儀離心機儀器有限公司,與我司相關技術人員交流探討。


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